质粒小量提取试剂盒(5～15mL)

产品货号：

WH0036

中文名称：

质粒小量提取试剂盒(5～15mL)

英文名称：

Plasmid DNA Mini Kit(5-15mL)

产品规格：

50次

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司新型材料，高效、专一吸附DNA，可去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。以下操作步骤适用于提取5～15mL过夜培养的大肠杆菌，质粒提取得率和质量与宿主菌的种类和培养条件，细胞的裂解，质粒拷贝数，质粒的稳定性，抗生素等因素有关。

本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。

产品特点：

快速：步骤少，操作简单，节省时间。
高效：可提取菌体85%以上质粒DNA。

质粒得率：

质粒类型	处理量	得率	质粒
高拷贝质粒	5～15mL	15～70μg	pTZ,pUC,pBS,pTG-T
低拷贝质粒	5～15mL	5～25μg	pBR322,pACYC及其衍生载体pSC101 及其衍生载体，SuperCos,pWE15

试剂盒组成：

组分	规格
平衡液BL	30mL
溶液P1	30mL
溶液P2	30mL
溶液P3	40mL
去蛋白液PD	30mL
漂洗液PW	15mL
洗脱缓冲液EB	15mL
RNaseA（10mg/ml)	300μL
吸附柱CP4	50个
收集管（2mL)	50个

保存条件：室温（15～25℃)干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于
2～8℃。2～8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀。第一次使用前将RNase A加入溶液P1中，混匀后置于2～8℃保存，可稳定保存12个月以上。单独包装的RNase A在室温可稳定保存12个月以上。

注意事项：（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项)

溶液P1在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2～8℃保存。
使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
注意不要直接接触溶液P2和P3，使用后应立即盖紧盖子。
所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心，速度为12000rpm （~13400×g)。
提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液应在65～70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。
实验前使用平衡液处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。
用平衡液处理过的柱子最好当天使用，放置时间过长会影响效果。
去蛋白液PD可以有效去除残留的蛋白杂质，当宿主菌为endA+（TG1、BL21、HB101、ET1256、JM101等）核酸酶含量较高的菌株时，强烈推荐使用去蛋白液PD。

使用方法：
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

柱平衡步骤：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000rpm（~13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
取5～15mL过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm （~13400×g)离心1min，尽量吸除上清。
注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。收集的菌体量以能够充分裂解为佳，菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率。
向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1（请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解。
注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果菌液没有变清亮，可能是由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm （~13400×g)离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。
注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
将上一步收集的上清液分次加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中，其容量为750～800μL)，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm （~13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
可选步骤：向吸附柱CP4中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm （~13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4重新放回收集管中。如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。如果宿主菌是endA宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。
向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
重复操作步骤8。
吸附柱CP4放入收集管中，12000rpm（~13400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100～300μL洗脱缓冲液EB，室温放置2～5min，12000rpm（~13400×g)离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于100μL，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0～8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，再次离心。

质粒DNA浓度及纯度检测：

得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为单一条带，也可能为2到3条DNA条带，这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。OD₂₆₀值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7～1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddH2O，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。

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